Western blotting

Immunoblotting is de overdracht van eiwitten naar een membraan en daaropvolgende detectie met behulp van antilichamen. Voor het bekende tot expressie gebrachte eiwit kan het overeenkomstige antilichaam worden gebruikt als het primaire antilichaam voor detectie.Het expressieproduct van het nieuwe gen kan worden gedetecteerd door het fusiedeel van het antilichaam en heeft de voordelen van grote analytische capaciteit, hoge gevoeligheid, sterke specificiteit, enz. Een van de meest gebruikte methoden voor expressie en distributie, zoals kwalitatieve en kwantitatieve detectie van weefselantigenen, massabepaling van polypeptidemoleculen en detectie van antilichamen of antigenen van virussen. Basis informatie Specialistenclassificatie: classificatie voor groei en ontwikkeling controleren: biochemisch onderzoek Toepasselijk geslacht: of mannen en vrouwen nuchter zijn: niet vasten Tips: Volg de instructies van de arts op. Normale waarde Geen speciale kleurreactie. Klinische betekenis Abnormale resultaten: er is een speciale kleurreactie, die bewijst dat een bepaald eiwit bestaat. Moet de menigte controleren: controleer op een bepaald eiwit. voorzorgsmaatregelen Taboe bij het aanvinken: Geen. Taboe bij het controleren: 1. De verdunning, actietijd en temperatuur van het primaire antilichaam en het secundaire antilichaam worden bepaald door pre-experiment om de optimale omstandigheden voor verschillende eiwitten te bepalen. 2. De kleurontwikkelingsoplossing moet nieuw worden geconfigureerd en gebruikt en ten slotte wordt H2O2 toegevoegd. 3, DAB heeft het potentieel voor carcinogeniteit, wees voorzichtig bij het hanteren. Inspectie proces (A) verkregen eiwitmonster: na bacteriële inductie van expressie kunnen de cellen direct worden gelyseerd door elektroforese-laadbuffer, eukaryotische cellen plus homogenisatiebuffer, mechanische of ultrasone kamertemperatuur homogenaat 0,5-1min. Het werd vervolgens 15 minuten bij 4 ° C bij 13.000 g gecentrifugeerd. Neem het supernatant als een monster. (2) Elektroforese: een elektroforese-gel werd bereid en onderworpen aan SDS-PAGE. (3) Overdracht: (semi-droge overdracht) 1. Nadat de elektroforese is voltooid, snijd de strip op de juiste grootte en equilibreer met de membraanbuffer, 5 min x 3 keer. 2. Membraanbehandeling: het filterpapier en het NC-membraan van dezelfde grootte als de strook werden voorgesneden en gedurende 10 minuten ondergedompeld in de overdrachtsbuffer. 3. Transferfilm: het filmtransferapparaat wordt in volgorde van onder naar boven geplaatst in de volgorde van anode-koolstofplaat, 24 lagen filterpapier, NC-film, gel, 24 lagen filterpapier en kathode-koolstofplaat.Het filterpapier, gel en NC-film zijn precies uitgelijnd. De bellen werden in één stap verwijderd en een gewicht van 500 g werd daarop aangebracht om de overtollige vloeistof op de koolstofplaat te drogen. Schakel de stroom in, constante stroom 1mA / cm2, overdracht 1,5 uur. Nadat de overdracht is voltooid, wordt de stroom verwijderd en wordt het membraan verwijderd en wordt de te testen strip gesneden voor immunoblotting. De standaard eiwitstrips werden gekleurd, gedurende 50 s in de membraankleuringoplossing geplaatst en vervolgens meerdere keren in 50% methanol ontkleurd tot een heldere achtergrond, vervolgens gewassen met dubbel gedestilleerd water, aan de lucht gedroogd in twee lagen filterpapier en liet kleuren De resultaten worden vergeleken. (4) Immuunrespons: 1. Was het membraan gedurende 5 minuten x 3 keer met 0,01 M PBS. 2. Voeg de coatingoplossing toe en schud voorzichtig gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. 3. Gooi de oplossing weg en was het membraan gedurende 5 minuten x 3 keer met 0,01 M PBS. 4. Voeg primair antilichaam toe (verdund met 0,01 M PBS in een geschikte verdunningsverhouding, de vloeistof moet het hele membraan bedekken) en laat het gedurende meer dan 12 uur bij 4 ° C staan. In de negatieve controle werd het primaire antilichaam vervangen door 1% BSA en de resterende stappen waren dezelfde als in de experimentele groep. 5. Gooi het primaire antilichaam en 1% BSA weg en was het membraan 5 maal × 4 keer met 0,01 M PBS. 6. Voeg mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam toe (verdund met 0,01 M PBS bij de juiste verdunningsverhouding) en schud voorzichtig gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. 7. Gooi het secundaire antilichaam weg en was het membraan gedurende 5 minuten x 4 keer met 0,01 M PBS. 8. Voeg de kleuroplossing toe, vermijd het licht en ontwikkel kleur totdat de band verschijnt Breng in het dubbel gedestilleerde water om de reactie te stoppen. Niet geschikt voor het publiek Niet geschikt voor het publiek: nee. Bijwerkingen en risico's Geen gerelateerde complicaties of gevaren.