Flowcytometrische DNA-analyse

Flowcytometrische DNA-analyse is een onderzoeksmethode die interfasecellen kan bestuderen en wordt niet beïnvloed door de staat van celproliferatie en is belangrijk voor het detecteren van kwaadaardige cellen in pleurale effusie. Flowcytometrie detectiebereik: 1. Flowcytometrie kan de celstructuur detecteren, inclusief celgrootte, celgrootte, celoppervlak, nucleoplasmatische verhouding, DNA-gehalte en celcyclus, RNA-gehalte, eiwitgehalte. 2. Flowcytometrie kan cellulaire functies detecteren, waaronder celoppervlak / cytoplasmatische / nucleaire specifieke antigenen, cellulaire activiteiten, intracellulaire cytokines, enzymactiviteiten, hormoonbindingsplaatsen en cellulaire receptoren. Basis informatie Specialistenclassificatie: cardiovasculair onderzoek classificatie: bloedonderzoek Toepasselijk geslacht: of mannen en vrouwen nuchter zijn: niet vasten Tips: Houd een normale mindset aan. Normale waarde Het lichaam is in een dynamisch evenwicht zonder ziekte. Klinische betekenis Klinische toepassing van flowcytometrie: 1. Toepassing van flowcytometrie in de oncologie Flowcytometrie kan tumorcelproliferatiecyclus detecteren, tumorceloppervlaktemarkers, oncogene expressieproducten detecteren, multidrugweerstandsanalyse uitvoeren en apoptose detecteren; 2. Toepassing van flowcytometrie in hematologie om leukemie en lymfoomcellen, geactiveerde bloedplaatjes, hematopoietische stamcel (CD34 +) tellingen, immunofenotyping van leukemieën en lymfomen, reticulocyten, celtransplantatie, celtransplantatie te detecteren, en Monitoring van de immuunstatus; 3. Flowcytometrie in immunologie kan worden gebruikt voor lymfocyten en zijn subgroepanalyse, lymfocytenimmunofenotypering, detectie van cytokines. Abnormale resultaten Er waren gegevens over flowcytometrie-analyse van 71 gevallen van pleurale effusie.De resultaten toonden aan dat de gevoeligheid van kwaadaardige pleurale effusie 52% was en de specificiteit 100%. In combinatie met routinematige tests kan de gevoeligheid van de diagnose oplopen tot 94%. DNA-analyse van kankerachtige pleurale effusiecellen toonde een toename van het aandeel aneuploïde en S-fase, G2 / M-fase cellen. Mensen die moeten worden onderzocht, worden ervan verdacht kanker pleurale effusie en andere gerelateerde ziekten te hebben. voorzorgsmaatregelen Flowcytometrie is geen volledig geautomatiseerd instrument. Nauwkeurige experimentele resultaten vereisen nauwkeurige handmatige technieken. Daarom moet de voorbereiding van het specimen worden gespecificeerd en vereist het instrument zelf kwaliteitscontrole. (1) Beïnvloedende factoren en kwaliteitscontrole van immunologische detectie van flowcytometrie Flowcytometrie heeft een breed scala aan toepassingen in de immunologie De bereiding van immunofluorescerende kleurspecimens is erg belangrijk, vaak vanwege het optreden van antropogene niet-specifieke fluorescentie-interferentie (vooral bij indirecte immunofluorescentiekleuring) of een lage celconcentratie tijdens de voorbereiding van het monster. Testresultaten. De oplossingen voor deze beïnvloedende factoren zijn als volgt: (1) Zorg ervoor dat de concentratie van het monster voordat de machine wordt gedetecteerd 1X106 cellen / ml is en dat de celconcentratie te laag is, wat rechtstreeks van invloed is op het detectieresultaat. (2) Het gebruik van eiwitblokkerende middelen om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren is vooral noodzakelijk voor indirecte immunofluorescentie-etikettering. Veelgebruikte eiwitblokkers zijn 0,5% runderserumalbumine en 1% foetaal runderserum. (3) Fluorescerend antilichaam wordt grondig gewassen na kleuring, let op de meng- en centrifugatiesnelheid en verminder overlappende cellen en celresten. (4) Een controlemonster werd opgesteld met behulp van een achtergrondcontrole van niet-gerelateerde controle en fluorescerende antilichamen die overeenkwamen met dezelfde bron van antilichamen. (5) Bij het beoordelen van het resultaat moet aandacht worden besteed aan het aftrekken van de achtergrondfluorescentie.Om de kwantitatieve analyse van immunofluorescentie nauwkeuriger te maken, wordt de computerprogrammasoftware gebruikt om de curvepiek van de controlegroep van de curvepiek van de experimentele groep af te trekken door middel van de fittingcurvemethode. Meer nauwkeurige kwantitatieve resultaten van immunofluorescentie kunnen worden verkregen. (6) Besteed aandacht aan het vermijden van licht na het verven om de stabiliteit van cellulaire immunofluorescentie te waarborgen. (2) Er is nog steeds geen uniforme standaard voor de kwaliteitscontrole van DNA-ploïdieanalyse. De experimentele resultaten die in verschillende literatuur worden gerapporteerd, verschillen nogal. In oktober 1993 ontwikkelde de American Cancer Research Organisation een uniforme standaard voor de bepaling van FCM-DNA, die we volgens deze normen combineerden. Ervaren experts oefenen al vele jaren om de kwaliteitscontrole en voorzorgsmaatregelen van de DNA-analysetechnologie van FCM uit te leggen. (1) Wanneer verse monsters voor chirurgische resectie of biopsienaalden worden genomen, moet het hemorragische necrotische weefsel worden vermeden. (2) Monsters moeten na verzameling worden gefixeerd of gecryopreserveerd om autolyse en DNA-afbraak te voorkomen, wat resulteert in fouten in de testresultaten. (3) Het fixeermiddel moet een concentratie aannemen die sterk doordringt in de weefselcellen en 70% van de ethanol is beter. (4) Zorg ervoor dat tijdens de bereiding van een celsuspensie de componenten van de te testen cellen worden gescheiden, de interferentie van andere componenten wordt beperkt en zorg ervoor dat de cellen niet worden beschadigd. (5) De verzameling van celmonsters moet zorgen voor voldoende celconcentratie, dwz 1 x 106 cellen / ml, onzuiverheden, puin, klonten en overlappende cellen moeten <2% zijn en ten minste 20% van de monsters van tumorcel-DNA-aneuploïden moet worden geanalyseerd. Tumorcellen zijn aanwezig. (6) Bij het bereiden van de enkele cel van in paraffine ingebed weefsel, moet aandacht worden besteed aan de selectie van het weefsel zonder autolyse en necrose. Voor het tumorweefselmonster wordt het gebied met de tumorcellen gekozen; de dikte van het paraffineweefselvel moet geschikt zijn, bij voorkeur 40 tot 50 m. Overmatig dunne of te dikke plakjes beïnvloeden de testresultaten; grondig ontwassen om te voorkomen dat resterende paraffine de spijsvertering van het enzym beïnvloedt. Controleer of het ontwassen voltooid is door xyleen weg te gooien en 100% ethanol toe te voegen. Drijvend, wat aangeeft dat de was is verwijderd; hydratatie is voldoende om het weefsel terug te brengen in een staat vergelijkbaar met vers weefsel; let op het tijdstip van vertering en de activiteit van spijsverteringsenzymen. 0,5% pepsine werd routinematig gebruikt, pH 1,5. (3) Operationele aspecten (1) De flowcytometer bevindt zich gedurende het gehele werkproces in een optimale staat, die de nauwkeurigheid en nauwkeurigheid van kwantitatieve detectie kan garanderen. Met behulp van het standaardmonster om de variatiecoëfficiënt van het instrument aan te passen aan het minimumbereik, bevindt de resolutie zich in de beste staat om detectiefouten te voorkomen die worden veroorzaakt door veranderingen in instrumentomstandigheden tijdens het meetproces. (2) De belangrijke index voor het evalueren van de nauwkeurigheid van het instrument is de variatiecoëfficiënt (CV) van het instrument.Voor het kalibratiemonster, hoe kleiner de CV-waarde, hoe kleiner de CV-waarde is, wat aangeeft dat de nauwkeurigheid van de instrumentkalibratie hoger is. Kalibratiemonsters omvatten niet-biologische monsters (fluorescerende microbolletjes) en biologische celmonsters (menselijke lymfocyten, rode bloedcellen van kippen, enz.). Momenteel hebben niet-bioluminescente microsferen commerciële reagentia en is CV in het algemeen <2% tot 3%. (4) Gegevensanalyse (1) Wanneer er teveel puin of agglomeraten in het monster zijn, is het aantal gemeten cellen minder dan 20% en moet de basislijn van het histogram worden verlaten. (2) Bij het uitvoeren van celcyclusanalyses moet het aantal monstercellen 10.000 zijn, exclusief puin, onzuiverheden en agglomeraten. Wanneer het aantal aneuploïde cellen minder dan 10% van het totale aantal cellen uitmaakt, is het noodzakelijk om andere diagnostische indicatoren te combineren. Concluderend zijn ten minste aneuploïde cellen goed voor meer dan 20% van het totale aantal cellen en kan de aanwezigheid van aneuploïden worden bepaald. (3) In de DNA-analyse werd de analyse verlaten wanneer de CV-waarde van de normale diploïde celgroep> 8% was, maar de CV-waarde van de tumorcellen> 8%, hetgeen gerelateerd was aan de heterogeniteit van de tumorcellen. Bij DNA-ploïdieanalyse zal bovendien 10% van de individuen in het homologe weefsel drijven. (4) Kwaliteitscontrole van DNA-ploïdienormen, met behulp van hetzelfde individuele homologe normale weefsel, dezelfde fixatiemethode, dezelfde monsterverwerkingsmethode, dezelfde kleurmethode, gelijktijdige kleuring, dezelfde instrumentdetectieomstandigheden, normaal diploïd weefsel Interne standaard. Inspectie proces Analyse van flowcytometrie: cellen in pleuravocht werden direct gekleurd met fluorescente kleurstoffen (zoals propidiumjodide), en DNA-gehalte, celcyclusverdeling en DNA-ploïdie van pleuravochtcellen werden geanalyseerd door flowcytometrie. Monstervoorbereiding voor routinetests met flowcytometrie: (1) Directe immunofluorescentie-etikettering Neem een bepaalde hoeveelheid cellen (ongeveer 1X106 cellen / ml), voeg direct het fluoresceïne-geconjugeerde antilichaam toe voor immunolabelingreactie (zoals dubbel-gemerkte of multi-gelabelde kleuring, voeg tegelijkertijd verschillende antilichamen toe die zijn gelabeld met verschillende fluoresceïne), incubeer Was na 20 tot 60 minuten 1 of 2 keer met PBS (pH 7,2 tot 7,4), suspendeer opnieuw in buffer en test op de machine. De methode heeft de voordelen van eenvoudige bediening, nauwkeurig resultaat en eenvoudige analyse en is geschikt voor het gelijktijdig bepalen van meerdere parameters van dezelfde celgroep. Hoewel de kosten van het direct gelabelde antilichaamreagens hoog zijn, vermindert het de interferentie van sterke niet-specifieke fluorescentie in de indirecte labelingsmethode en is het daarom geschikter voor de detectie van klinische monsters. (twee) indirecte immunofluorescentie-etikettering Neem een bepaalde hoeveelheid celsuspensie (ongeveer 1X106 cellen / ml), voeg eerst een specifiek eerste antilichaam toe, was het ongebonden antilichaam nadat de reactie is voltooid en voeg vervolgens een fluorescent gemerkt secundair antilichaam toe om een antigeen-antilichaam-antilichaamcomplex te vormen De FCM detecteert de fluorescentie die wordt uitgezonden door de gelabelde fluoresceïne nadat deze is geëxciteerd. De methode is goedkoop en het secundaire antilichaam wordt veel gebruikt en wordt meestal gebruikt voor de detectie van wetenschappelijke monsters. Aangezien het secundaire antilichaam echter in het algemeen een polyklonaal antilichaam is, is de specificiteit slecht en is de niet-specifieke fluorescerende achtergrond sterk, wat gemakkelijk de experimentele resultaten beïnvloedt. Daarom moet een negatieve of positieve controle worden toegevoegd aan de bereiding van het monster. Bovendien is door het grote aantal stappen in de standaard labelmethode het verlies aan cellen toegenomen en is het niet geschikt om monsters met een klein aantal cellen te meten. Niet geschikt voor het publiek Geen.

heeft dit artikel jou geholpen?

Het materiaal op deze site is bedoeld voor algemeen informatief gebruik en is niet bedoeld als medisch advies, waarschijnlijke diagnose of aanbevolen behandelingen.